Что такое CRISPR: как молекулярные ножницы меняют генотип будущих поколений

Что такое CRISPR?

CRISPR (Сlustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) — часть защитной системы бактерий, которая может разрезать ДНК. Ученые научились использовать ее как инструмент для изменения генов, работающий как точные молекулярные ножницы, способные разрезать ДНК в нужном месте под руководством специального проводника.

Система состоит из двух основных элементов: фермента, который разрезает ДНК (Cas), и РНК-проводника, который указывает, куда ферменту надо идти. Такая система была впервые обнаружена в бактериях – она помогает защищаться от вирусов, разрезая их ДНК. После того как ученые поняли, как работает система, они стали использовать ее для изменения ДНК в любых организмах.

CRISPR важен, потому что позволяет ученым менять генетический код практически любого организма быстро, дешево и точно. Такой механизм открывает огромные возможности, например, для лечения генетических болезней и создания устойчивых к засухе растений.

История и открытие CRISPR

CRISPR сейчас известен как точный инструмент для изменения генов, но до его открытия ученые долгое время пытались понять его природу и возможности.

Кто открыл CRISPR?

CRISPR был открыт доктором Дженнифер Даудна из Калифорнийского университета в Беркли (Калифорния, США) и доктором Эммануэль Шарпантье из Института физики Общества Макса Планка (Мюнхен, Германия). Важная работа ученых, которая показала, что система CRISPR-Cas9 может быть использована для изменения генов, была опубликована в 2012 году. За свое открытие женщины получили Нобелевскую премию по химии в 2020 году.

Другие важные ученые, сделавшие свой вклад в развитие технологии, включают Фенга Чжана из Института Броуда, который первым применил CRISPR в клетках высших организмов, и Джорджа Черча из Гарвардской медицинской школы, который показал работу CRISPR в человеческих клетках.

История CRISPR

Доктор Франциско Мохика из Испании первым идентифицировал CRISPR как часть бактериальной защиты и предложил название механизму. Работа Франциско в 1993 году и последующие эксперименты других ученых привели к тому, что CRISPR стал использоваться как мощный инструмент для редактирования генов.

С момента адаптации Даудной и Шарпантье технология CRISPR быстро развивалась и нашла применение в различных областях, от медицины до сельского хозяйства.

В 2023 году CRISPR вызвал настоящий фурор в мире биотехнологий. В ноябре инструмент редактирования генов получил первое клиническое одобрение в Великобритании для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии — болезней крови, вызванных одной генетической ошибкой. Американское Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов (Food and Drug Administration, FDA) также одобрило терапию для серповидноклеточной анемии и готовится вынести решение по бета-талассемии к марту следующего года.

Механизм CRISPR

CRISPR работает, используя систему, которая напоминает «память» бактерии о вирусах, с которыми она сталкивалась в прошлом. Бактерии собирают кусочки ДНК вирусов и хранят их в своем собственном геноме в виде CRISPR-последовательностей. Когда тот же вирус пытается атаковать бактерию снова, CRISPR использует «сохраненнную» ДНК как шаблон, чтобы распознать и разрезать вирусную ДНК, предотвращая инфекцию.

В лабораторных условиях ученые адаптировали такой механизм для целенаправленного изменения генов. Специалисты создают РНК-проводник, который соответствует специфическому участку в ДНК целевого организма. Проводник приводит фермент Cas9 к этому участку, где он делает точный разрез. После разреза клетка пытается восстановить повреждение, и в этот момент ученые могут вносить изменения в геном, например, удаляя, заменяя или добавляя генетический материал.

Методы и техники CRISPR

Механизм редактирования генома CRISPR

CRISPR предлагает несколько подходов к редактированию генов:

• CRISPR-Cas9. Самый распространенный и широко известный метод редактирования генома с использованием системы CRISPR-Cas9. Включает в себя создание двуцепочечного разрыва в ДНК (double-stranded breaks, DSB) в месте, куда направлен РНК-проводник. После разрыва ДНК клеточные механизмы восстановления вступают в действие, что позволяет вносить изменения в геном — будь то удаление, замена или добавление генетических фрагментов.
• CRISPR-Cpf1 (Cas12a). Другой тип системы CRISPR, который, в отличие от Cas9, создает «липкие концы» при разрезе ДНК. Такой механизм предоставляет дополнительные возможности для редактирования генома, так как «липкие концы» могут облегчить вставку новых генетических последовательностей. Cas12a также отличается специфичностью к PAM-последовательностям (Protospacer adjacent motif), что расширяет спектр потенциальных целей для редактирования.
• Base Editing. Метод, позволяющий изменять отдельные нуклеотиды (основа ДНК) без создания разрывов в двойной спирали ДНК. Это достигается путем слияния никазы Cas9 или «мертвой» Cas9 (dead Cas9, dCas9), которая не может создавать разрывы, с ферментом, модифицирующим ДНК. Базовое редактирование позволяет эффективно исправлять мутации на однонуклеотидном уровне, минимизируя риски, связанные с нецелевым редактированием генома.
• Prime Editing. Продвинутая форма редактирования генома, которая объединяет в себе преимущества CRISPR-Cas9 и Base Editing, позволяя вносить широкий спектр изменений в геном, включая вставки, делеции и замены. Метод использует специально разработанный РНК-проводник (prime editing guide, pegRNA), который содержит как целевую РНК, так и шаблон для редактирования. Prime Editing может корректировать генетические дефекты с высокой точностью и меньшим количеством побочных эффектов.
• CRISPRa и CRISPRi. CRISPR активация (CRISPR activation, CRISPRa) и CRISPR интерференция (CRISPR interference, CRISPRi) являются методами для управления активностью генов без изменения их последовательности. CRISPRa используется для увеличения экспрессии (активности) генов, а CRISPRi — для их подавления. Оба метода используют (dCas9), которая не может разрезать ДНК, но может быть направлена к конкретным генам с помощью РНК-проводников для модуляции их активности.
• Скрининги CRISPR (CRISPR screens). Скрининг с использованием CRISPR — это мощный подход для идентификации генов, играющих ключевую роль в определенных биологических процессах или заболеваниях. Такой метод включает создание больших библиотек РНК-проводников, нацеленных на множество генов, что позволяет анализировать их функции в различных условиях и определять потенциальные цели для лечения.

Технология CRISPR-Cas9 позволила провести высокоточные крупномасштабные скрининговые исследования для поиска лекарств, что позволяет разгадать взаимосвязь между генотипом и фенотипом. Скрининг CRISPR обычно включает в себя создание большой библиотеки sgRNA, нацеленной на различные гены, внесение широкого спектра изменений в конкретную линию клеток, а затем анализ влияния изменений на фенотип клеток.

После того как библиотека РНК-проводников доставлена в клетки, и фермент Cas9 внес изменения в их ДНК (включение, выключение или изменение определенных генов), ученые должны отобрать те клетки, которые реагируют на изменения нужным образом. Отбор может быть основан на физических признаках клеток (их фенотипе), изменениях в их поведении, выживаемости, росте, взаимодействии с другими клетками или на их способности к выполнению определенных функций.

4 ключевых применения технологии CRISPR

1. Медицинские исследования и терапии: CRISPR используется для изучения генетических основ болезней и разработки новых генных терапий, например, для лечения наследственных заболеваний, таких как серповидноклеточная анемия и муковисцидоз.
2. Сельское хозяйство: С помощью CRISPR создаются культуры с улучшенными характеристиками, такими как устойчивость к вредителям и болезням, увеличенный урожай и лучшая адаптация к изменениям климата.
3. Биоэнергетика: Исследователи используют CRISPR для улучшения производства биотоплива, например, путем увеличения содержания липидов в водорослях, что делает их более эффективными источниками энергии.
4. Диагностика: CRISPR применяется в разработке новых, более чувствительных и точных методов диагностики заболеваний, включая инфекционные болезни, как это было продемонстрировано во время пандемии COVID-19.

CRISPR в лечении заболеваний животных

CRISPR позволяет создавать точные модели заболеваний в клетках, что критически важно для понимания механизмов болезней и разработки новых методов лечений. Например, с помощью CRISPR можно модифицировать геном мышей для воспроизведения человеческих заболеваний, изучать прогрессирование болезни и тестировать потенциальные лекарства.

Клиническое одобрение терапии на основе CRISPR открывает путь для новых поколений технологии, включая базовое и первичное редактирование. Например, базовое редактирование (Base Editing) уже используется в испытаниях для лечения рака. Альтернативой является «однократный укол», который в небольшом клиническом испытании показал снижение уровня холестерина на 55%.

Стоит упомянуть, что британская компания Genus, специализирующаяся на генетике животных, представила свиней, устойчивых к вирусу репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), известному также как «синее ухо», часто приводящему к летальному исходу. Genus предложила решение, используя технологию CRISPR для редактирования генов свиней таким образом, чтобы те стали полностью устойчивы к вирусу PRRS. Изменения были внесены на раннем этапе эмбрионального развития, благодаря чему поросята стали полностью устойчивыми к вирусу, даже находясь в непосредственной близости с инфицированными особями.

Как начать работать с CRISPR

Для начала работы с CRISPR необходимо:

1. Определить цель редактирования: четко определите, какие изменения вы хотите внести в геном.
2. Разработать конструкцию РНК-проводника: используйте специализированные программы для разработки РНК-проводника, который точно нацелит фермент Cas на нужное место в геноме.
3. Выбрать систему доставки: определите, как вы будете доставлять компоненты системы CRISPR (РНК-проводник, фермент Cas и, при необходимости, шаблон для восстановления) в целевые клетки.
4. Организовать эксперименты: проведите эксперименты, следя за всеми необходимыми условиями безопасности и этическими нормами.
5. Проанализировать результаты: используйте методы молекулярной биологии для проверки эффективности и точности внесенных изменений.

Работа с CRISPR требует тщательного планирования и внимания к деталям, но возможности, которые он открывает, огромны и могут принести значительные преимущества в медицине, науке и сельском хозяйстве.

Будущее CRISPR

Не может быть сомнений в том, что технология CRISPR революционизировала область инженерии генома. Однако мы только начинаем видеть преимущества и возможности невероятной технологии – с разнообразием успешных доклинических исследований и все большим количеством одобренных клинических испытаний, мечта о лечении человеческих заболеваний путем редактирования ДНК теперь вполне исполнима.

Также увеличивается количество биотехнологических стартапов, сосредоточенных на технологии редактирования генов CRISPR-Cas9, и многие исследователи постоянно находят новые способы применения технологии для решения реальных проблем, включая редактирование эпигенома, новые клеточные и генные терапии, исследования инфекционных заболеваний и сохранение исчезающих видов.